VU GMC mokslininkų atrastas metodas atveria naujas galimybes individualių su DNR sąveikaujančių baltymų elgsenos tyrimams

Vilniaus universiteto Gyvybės mokslų centro (VU GMC) mokslininkų komanda, įgyvendindama Lietuvos mokslo tarybos finansuojamą projektą, tarptautiniame žurnale „Febs Open Bio“ publikavo metodologinį straipsnį, kuriame pristatė būdą, leidžiantį DNR ir baltymų sąveikas tirti pavienių molekulių lygmeniu, naudojant pažangią optinę fluorescencinę mikroskopiją. 

DNR ir su ja sąveikaujantys baltymai yra gyvybės procesų pagrindas. Būtent šios sąveikos lemia vienų genų aktyvavimą ar kitų slopinimą, DNR pažaidų atpažinimą ir taisymą bei genetinės informacijos perdavimą. Norint geriau suprasti šiuos dinaminius procesus ir išsiaiškinti jų mechanizmus, būtina turėti tyrimų metodus, leidžiančius nepertraukiamai realiu laiku stebėti tokių individualių baltymų veiksmus. 

Kodėl svarbu matyti pavienę molekulę?

Pasak tyrimui vadovaujančio dr. Marijono Tutkaus, tradiciniai biochemijos metodai dažnai „paslepia“ individualų molekulių elgesį, nes atspindi trilijonų molekulių vidutinę stebimo parametro vertę.     

„Jeigu vienu metu stebime trilijonus molekulių, matome parametrą, kuris atspindi visų jų bendrą elgseną. Tačiau pavienių molekulių metodai leidžia pamatyti, kaip iš tikrųjų elgiasi konkretus DNR ir baltymo kompleksas – kada jis prisijungia, kiek laiko išlieka, ar juda DNR grandine. Toks stebėjimo būdas taip pat leidžia atmesti nefunkcionalius baltymus, kurie kitu atveju iškraipytų stebėjimo rezultatus“, – aiškina mokslininkas.

VU GMC tyrėjų taikomas metodas remiasi vadinamąja DNR ištempimo srovės (angl. low-stretch) sistema: ilgi DNR molekulių fragmentai, pritvirtinami prie stiklo paviršiaus, pažymimi į DNR įsiterpiančiais fluorescuojančiais dažikliais ir naudojant skysčio tėkmę specialiame tėkmės kanale yra ištempiami. Tokiu būdu molekulės tampa tarsi „matomos“ – išsidėsto linijiškai ir gali būti stebimos naudojant TIRF (viso vidinio atspindžio) fluorescencinę mikroskopiją.

Pasak dr. M. Tutkaus, būtent toks DNR ištempimas leidžia vienu metu stebėti atskiras molekules ir jų sąveikas. „Kai DNR molekulė yra ištempta ir prigludusi prie paviršiaus, galime labai tiksliai matyti, kas vyksta konkrečioje vietoje“, – sako mokslininkas. Ši pažangi mikroskopijos rūšis, kurią vysto mokslininkų komanda, yra nepakeičiama šiam tyrimo metodui, nes leidžia ypač gerai matyti žymėtas molekules. 

Nuo paviršiaus chemijos iki molekulių stebėjimo realiu laiku 

Vienas svarbiausių metodo aspektų – kruopštus stiklo paviršiaus paruošimas. Tyrėjai optimizavo paviršiaus dengimo chemiją taip, kad DNR molekulės būtų tvirtai imobilizuotos, tačiau tuo pačiu būtų sumažintas nespecifinis tiramųjų su DNR sąveikaujančių baltymų prisijungimas ant stiklo paviršiaus.

Straipsnyje detaliai aprašomi visi metodo etapai – nuo DNR fragmentų paruošimo ir jų pažymėjimo bei modifikavimo biotinu ar digoksigeninu iki DNR molekulių pritvirtinimo prie paviršiaus abiem galais ir jų fluorescencinio žymėjimo. Pasak dr. M. Tutkaus, toks išsamus metodikos aprašymas yra svarbus, kad ją galėtų pritaikyti ir kitos laboratorijos. „Mums buvo svarbu ne tik parodyti, kad metodas veikia, bet ir pateikti aiškų protokolą, kurį galėtų perimti kiti tyrėjai. Tokį poreikį dažnai girdime įvairiose konferencijose. Daugeliui tyrėjų ypač svarbus kokybiškas ir patikimas stiklo paviršiaus modifikavimas, kurį esame ištobulinę“, – sako dr. M. Tutkus.

Tarptautinis Lietuvos ir Taivano bendradarbiavimas

Metodo įgyvendinimui reikalingos cheminės medžiagos stiklo paviršiaus modifikavimui buvo sukurtos bendradarbiaujant su prof. Chun-Jen Huang komanda iš Taivano. „Ši tyrėjų grupė kuria ir tiria silatranus – specialios struktūros cheminius junginius bei yra laikoma viena iš pasaulinių šios srities lyderių. Jų sukurtos unikalios molekulės leidžia ant stiklo paviršiaus suformuoti ypač stabilų, ploną ir tolygaus aukščio molekulių monosluoksnį. Cviterioniniai silatranai užtikrina efektyvų nespecifinį baltymų atstūmimą. Tuo tarpu aminu funkcionalizuoti silatranai sudaro galimybę prie paviršiaus prijungti DNR molekules“, – apie kolegų iš Taivano sukurtų molekulių unikalumą kalbėjo mokslininkas. Verta pažymėti, kad Chun-Jen Huang ir Van Truck Vu taip pat yra šio straipsnio bendraautoriai.

„Tokie tarptautiniai ryšiai leidžia sujungti skirtingas kompetencijas. Paviršiaus chemija yra kritinis elementas tokiuose eksperimentuose. Mūsų partnerių sukurti junginiai leido pasiekti stabilesnį ir patikimesnį DNR imobilizavimą. Manome, kad jie pravers ir bus aktualūs kitiems tyrėjams“, – pasakoja dr. M. Tutkus.

Naujas metodas lengvesniems ir paprastesniems tyrimams ateityje 

Metodas jau pritaikytas tiriant garsiųjų genų žirklių – CRISPR-Cas sistemų baltymų sąveiką su DNR, prie kurių atradimo žymiai prisidėjo ir VU GMC mokslininko prof. Virginijaus Šikšnio komanda.  

Anot mokslininko, tokiuose metodiniuose darbuose pristatomi nauji tyrimų metodai gali tapti lengviau prieinami ir paprasčiau naudojami, ilgainiui – plačiai paplisti ir tapti standartiniu įrankiu kuriant ir testuojant naujus su DNR sąveikaujančius baltymus. 

Tokių naujų metodų atradimas svarbus ne tik fundamentiniams molekulinės biologijos tyrimams, bet ir biotechnologijoms, pritaikomoms medicinoje. „Kuo geriau suprasime molekulių elgesį pavienių molekulių lygmeniu, tuo tiksliau galėsime valdyti genetinius procesus ir galiausiai kurti genų redagavimo sistemas, kurias ateityje būtų galima saugiai taikyti žmogaus ligų gydymui“, – teigia dr. M. Tutkus.